生长因子的溶解法 大肠杆菌生物膜的筛选及生长曲线测定.pdf
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中国农学通报2014,30(5):23-引言细菌生物膜(，BF)是相对于单个、分散的、浮游状态的细菌()生存形式而言的一种独特的细菌生存形式。生物被膜是细菌生长的一种保护模式，保证细菌在恶劣环境下可以生存[1]。对于生物膜的研究，2002年，等[2]认为：生物被膜是一种不可逆的粘附于非生物或生物表面的微生物细胞菌落，包裹于细胞外多聚物基质(，EPS)中（主要是多聚糖），生物膜中存在蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物质[3]。生物膜是细菌在恶劣环境中的一种生长方式，环境中的营养成分、温度、渗透压、pH、铁离子浓度、氧化还原电位变化等对生物膜的形成具有重要作用[4]。生物膜可由纯菌种形成，也可以由多菌种组成[5]。生物膜系统存在着通道系统，保证养料、酶、代谢产物和排泄物运输畅通[6]。1978—1995年，等[7]研究牙菌斑，提出生物被膜的理论，解释了微生物为何附着于有生命或无生命的物体表面及受益于这种小生境的机制。
他认为：生物被膜包括单个细胞和微生物菌落，镶嵌在一种高度水合化，主要携带负电荷的多聚物基质粘附于表面、界面及相互之间，在多孔基质孔隙中隐藏的细菌生物膜的感染性疾病大都是慢性和难治性的，生物膜内的细菌几乎对所有的抗生素都不敏感，表现出极强的耐药性[7]。基金项目：国家自然基金“新疆地区犊牛腹泻病中大肠杆菌基因型分型及bfpA基因生物学功能探讨”()。第一作者简介：喻华英，女，1967年出生，新疆人，硕士，教授，现从事家畜病理学教学研究工作，研究方向为细菌和细菌毒素的致病机制。通信地址：新疆塔里木大学动科院，Tel：0997-，E-mail：@126。收稿日期：2013-07-01，修回日期：2013-10-05。大肠杆菌生物膜的筛选及生长曲线测定喻华英，李启峰（塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔）摘要：为探究犊牛腹泻病中大肠杆菌生物膜的形成过程。本试验利用96孔微量板法，对分离鉴别的犊牛腹泻粪便中的60株大肠杆菌进行生物膜的筛选和统计。结果表明：得到了9株生物膜阳性大肠杆菌，并测定出大肠杆菌生物膜阳性菌的生长曲线。从而确定大肠杆菌生物膜形成的四个时期：初粘附、粘附、生物膜的成熟、脱落等过程且不同大肠杆菌生物膜形成时间不尽相同。
为临床上治疗犊牛腹泻病提供了新的理论依据。关键词：大肠杆菌；生物膜；筛选；生长曲线中图分类号：R3782+2Q735文献标志码：A论文编号：2013-ng,(,):.a.96-….coli.:,,,.coli..:;;;中国农学通报生物膜的形成后，细菌个体表现不同致病性特性，某些细菌个体对宿主无危害，有些细菌则可能对宿主有致命威胁。
生物膜中特有的物质如胞外多聚物和群体感应信号因子都可能是使其抗性增强的原因[8-9]。大约65%的人类细菌性感染是细菌由生物膜引起的[10-12]。生物膜形成后可引起机体严重的反复感染[13-14]。能形成生物膜的细菌有金黄色葡萄球菌、副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、枯草杆菌、沙门杆菌、志贺氏菌、变形杆菌、绿脓杆菌、炭疽杆菌、蜡样芽胞杆菌、葡萄球菌等。大肠杆菌形成生物膜与自身的结构如粘附因子、毒力因子、细胞坏死因子和铁载体等有关，还与细菌所生存的环境有关[14-15]。大肠杆菌能在口腔、尿道、生殖道、肠道等器官表面形成生物膜，导致疾病出现反复感染[16-17]。在新疆地区，养牛业出现快速迅猛发展并成为农牧民增收的主要手段之一。犊牛腹泻病的危害在养牛业中危害越来越严重，同时致犊牛腹泻病的大肠杆菌普遍存在对抗生素有较强的耐药性、反复性感染、不易根治和致病力强等特点。本试验用的96孔微量板法，对致犊牛腹泻病的大肠杆菌进行生物膜的筛选和分析，并探究其生物膜的形成过程，为临床上犊牛腹泻病的治疗提供新的思路。1试验材料1.1试验材料试验病料是于2012年10月采自十团奶牛场中发生腹泻的犊牛粪便，经试验室分离鉴定的60株大肠杆菌。
1.2试验所用培养基麦康凯琼脂培养基、LB液体培养基、M9培养基。1.3试验试剂1%PBS缓冲溶液、1%结晶紫( ) 液，33 %冰乙酸，甲醇。1.4 试验设备与仪器紫外线可见分光光度计CODES 54；全波长酶标仪Power Wave XS 美国产；进口U型96 孔板(3599)购自 产品。2 试验方法2.1 大肠杆菌生物膜筛选-96孔微量板法2.1.1 细菌的活化和分离纯化（1）从-70℃冰箱中取出甘油保存的菌株，待菌液在冰浴下溶解后，取100 μL 菌液接种于新鲜灭菌的5 mL LB液体培养基中，置于37℃恒温摇箱中过夜培养；（2）将菌液接种于麦康凯培养基中。置于37℃恒温培养箱内培养24 h；（3）从麦康凯培养基中挑取红色单菌落，接种到新鲜灭菌的5 mL LB液体培养基中，于37℃恒温摇箱中摇16 h；（4）按1:100倍稀释：取培养的菌液50 μL 于新鲜灭菌的5 mL LB 试管液体培养基中，于37℃恒温摇箱中摇4.5 h，保证细菌处于对数生长期。2.1.2 菌液的测量及稀释（1）将紫外可见分光光度计预热半小时；（2）取2 mL菌液于干净比色皿中，同时取2 mL LB液体培养基作为空白对照；（3）调整当前波长为600 nm，初始波长为200 nm；（4）测菌液值，记录数据；（5）用灭菌的1×M9液体培养基将所测值稀释至0.01。
2.1.3 装板和培养 取200 μL稀释至0.01 的菌液加入96 孔U型平底板中，每个菌液接2 列6 孔，用1×M9 液体培养基200 μL接剩余2孔作为空白对照。将板置于37℃恒温箱中培养36~48 h。2.1.4 洗板（1）将培养好的96 孔U型平底板从恒温箱中取出，弃菌液；用1%PBS 缓冲液洗96 孔U型平底板，重复3次，弃洗液，拍干；将甲醇放入96孔U型平底板中固定15 min，倒出并晾干；将1%结晶紫溶液加入96孔U型平底板中，水平晃动，使生物膜染色均匀，染色5 min，自来水冲洗，晾干。（2）将培养好的96 孔U型平底板从恒温箱中取出，弃菌液；用1%PBS 缓冲液洗96 孔U型平底板，重复3次，弃洗液，拍干；将甲醇放入96孔U型平底板中固定15 min，倒出并晾干；将1%结晶紫溶液加入96 孔U型平底板中，水平晃动，使生物膜染色均匀，染色5 min，自来水冲洗，晾干。2.1.5 溶解和测 的值 将33%的冰醋酸加于96 孔U型平底板中，待细菌生物膜完全溶解后，用全波长酶标仪测定。对试验所得数据进行处理，基于临界值ODc，菌株生物膜可以分为：OD≤ODc 为不粘附(-)；ODc＜OD≤2ODc 为弱粘附(+)；2ODc＜OD≤3ODc 为中等粘附(++ )；OD＞3ODc 强粘附(+++) 。
2.2 大肠杆菌生物膜的生长曲线检测-96孔微量板法2.2.1 菌体的培养（1）从麦康凯培养基中挑出9株阳性大肠杆菌，用接种环挑取红色单菌落，接种到新鲜灭菌的5 mL LB液体培养基中，于37℃恒温摇箱中摇16 h。（2）按1:100 倍稀释：取培养的菌液50 μL于新鲜灭菌的5 mL LB试管液体培养基中，于37℃恒温摇箱中摇4.5 h，保证细菌处于对数生长期。2.2.2 菌液的测量及稀释· ·24喻华英等：大肠杆菌生物膜的筛选及生长曲线测定（1）将紫外可见分光光度计预热半小时；（2）取2 mL菌液于干净比色皿中，同时取2 mL LB液体培养基作为空白对照；（3）调整当前波长为600 nm，初始波长为200 nm；（4）测菌液值，记录数据；（5）用灭菌的1×M9液体培养基将所测值稀释至0.01。2.2.3 装板和培养 取200 μL稀释至0.01 的菌液加入96 孔U型板中，每个菌液接2 列6 孔，并用1×M9 液体培养基200 μL接剩余的2 孔，作为空白对照。将接8株弱阳性菌的96 孔U型板置于37℃培养，分别在12、24、36、48、60、72 h取板。
将接1株强阳性菌96孔U型板置于37℃培养，分别在2、4、8、12、24、36、48 h取板。2.2.4 洗板（1）将不同培养时间的96 孔U型板取出，弃菌液；（2）用1%PBS 缓冲液洗96 孔U型平底板，重复三次，弃洗液，拍干；（3）将甲醇放入96孔U型平底板中固定15 min，倒出并晾干；（4）将1%结晶紫溶液加入96孔U型平底板中，水平晃动，使生物膜染色均匀，染色5 min，自来水冲洗，晾干。2.2.5 溶解和测 的值 将33%的冰醋酸加于96孔U型平底板中，待细菌生物膜完全溶解后，用全波长酶标仪测定。对试验所得数据按照时间不同进行分析处理并绘制生长曲线。3 结果与分析3.1 大肠杆菌生物膜筛选结果本次试验利用96 孔微量板法，经结晶紫染色，冲洗晾干后，在96孔U型平板底部，可看到一层均匀、淡紫色的薄膜，初步判断为大肠杆菌形成的生物膜，并且能够形成厚薄不同的生物膜（见图1）。从60株大肠杆菌进行了生物膜的筛选，得到9株生物膜阳性菌，阳性率为15%，其中１株大肠杆菌生物膜呈现出强阳性。3.2 大肠杆菌生物膜粘附性分析结果基于临界值ODc，菌株生物膜可以分为：OD≤ODc 为不粘附(-)；ODc＜OD≤2ODc 为弱粘附(+)；2ODc＜OD≤3ODc 为中等粘附(++)；OD＞3ODc 强粘
